I. Akt: Im Maul des Löwen
Im Innenhof des Dogenpalastes in Venedig feiern die Menschen die jährliche Regatta. Barnaba, ein Spion und ehemaliger Informant der Inquisition, wacht über die Feierlichkeiten. Als er sieht, wie die schöne Sängerin La Gioconda ihre blinde Mutter La Cieca über den Innenhof führt, wird sein Verlangen geweckt. La Gioconda lässt ihre Mutter stehen, um in der Menge nach ihrem Geliebten Enzo zu suchen, und Barnaba folgt ihr nach. Als er von ihr schroff zurückgewiesen wird, stellt sich Barnaba vor, Rache zu nehmen, indem er La Giocondas fragile Mutter angreift.
Die Menschen begrüßen den Gewinner der Regatta mit Jubel. Einer der Verlierer, Zuàne, hat Schwierigkeiten, seine Niederlage zu akzeptieren. Barnaba flüstert ihm ein, dass er seine Niederlage einem finsteren Zauber von La Cieca verdankt. Als Zuàne diese Worte hört, rufen seine Unterstützer, dass La Cieca eine Hexe ist und dass sie hingerichtet werden sollte. Als Barnaba im Begriff ist, sie verhaften zu lassen, versucht Enzo, sie zu verteidigen. Der junge Mann steht im Konflikt mit den Menschen, die laut und deutlich verlangen, dass die alte Frau gelyncht wird.
Alvise Badoero, einer der Anführer der Inquisition, und seine maskierte Frau, Laura Adorno, kommen, um die Ursache der Störung zu ermitteln. Barnaba drängt sie, La Cieca zu verurteilen, aber Laura, bewegt durch die Bitten von La Gioconda, schafft es, ihren Mann davon zu überzeugen, sie freizulassen. In Dankbarkeit überreicht La Cieca Laura ihren Rosenkranz.
Barnaba lässt Enzo verstehen, dass er von seiner Gnade abhängig ist: Der Spion weiß, dass der junge Mann der verstoßene Enzo Grimaldo ist, der heimlich nach Venedig zurückgekehrt ist, und dass seine Beziehung zu La Gioconda nur dazu dient, seine wahre Liebe zu Laura zu verbergen.
Nachdem Enzo sich auf sein Rendez-vous mit Laura in dieser Nacht vorbereitet hat, schreibt Barnaba Alvise einen anonymen Brief vor, in dem er ihm von Lauras Plan erzählt, mit dem Verstoßenen zu fliehen. Barnaba legt den Brief in den Rachen eines löwenförmigen Briefkastens, in dem die Venezianer ihre anonymen Anklagen gegen das Gesetz verwerfen können. La Gioconda, die die Kirche verlassen hat, hört unbemerkt zu und und erfährt von Barnabas Offenbarung der wahren Liebe Enzos. Ihr Herz ist gebrochen, während Barnaba sich freut: Als Spion hält er sich für mächtiger als der Dogen.
II. Akt: Der Rosenkranz
Enzo wartet auf seinem Boot, während die Crew sich auf die Abfahrt vorbereitet. Er glaubt schon, dass Laura nicht mehr wie geplant kommen wird, als Barnaba sie doch zum Boot führt. Die Liebenden umarmen sich gegenseitig und träumen von ihrem neuen gemeinsamen Leben.
La Gioconda kommt aus ihrem Versteck auf dem Boot und kann ihre Eifersucht und ihren Hass auf Laura nicht unterdrücken. Die Sängerin will sie erstechen, aber als sie Alvise auf einem anderen Boot herannahen sieht, beschließt sie, Laura stattdessen der Rache ihres Mannes auszuliefern. In Verzweiflung packt La Gioconda den Rosenkranz ihrer Rivalin. Sie erkennt ihn als den La Cieca und begreift, dass Laura diejenige ist, die ihre Mutter vor dem Tod bewahrt hat. Um ihre Schuld zu begleichen, lässt die Sängerin Laura entkommen, indem sie ihr ihr eigenes Boot zur Verfügung stellt.
Enzo bemerkt Lauras Verschwinden und steht La Gioconda gegenüber. Sie weist ihn auf die venezianischen Galeeren hin, die sein Boot umzingeln. Verzweifelt setzt der Ausgestoßene sein Boot in Brand und schwimmt davon.
III. Akt: Das goldene Haus
Während in der Ca' d'Oro, einem der reichsten Paläste am Großen Kanal von Venedig, ein Ball beginnt, rächt sich Alvise an seiner Frau. Er beschließt, sie dazu zu bringen, Gift zu trinken und damit zum Selbstmord zu zwingen und sie damit in die Hölle zu verdammen. Er zeigt Laura eine Totenbahre, die für sie bestimmt ist, und gibt ihr ein Fläschchen mit Gift zum Trinken vor dem Ende des Balles.
La Gioconda hat ihren Weg in den Palast gefunden und findet Laura allein, gerade als sie das Gift einnehmen will. Die Sängerin tauscht das tödliche Getränk ihrer Rivalin gegen eine starke Droge aus, die die junge Frau in einen tiefen Schlaf versetzen wird, der sie wie tot erscheinen lässt.
Alvise sieht nach seiner Frau und findet Lauras Leiche auf der Totenbahre neben dem leeren Fläschchen. Er ist zufrieden mit seiner Rache und begrüßt seine Gäste zum Ball, darunter Enzo in Verkleidung sowie Barnaba. Für reichhaltige Unterhaltung ist gesorgt, darunter ein üppiges Ballett, der Tanz der Stunden. Die Stimmung der Feierlichkeiten ist erschüttert, als eine Totenglocke zu läuten beginnt und Lauras regloser Körper enthüllt wird. Der verzweifelte Enzo wirft seine Verkleidung ab und wird sofort von den Männern von Alvise festgenommen.
IV. Akt: Der Orfano-Kanal
Noch schlafend wird Laura von zwei Männern heimlich in das Haus von La Gioconda gebracht. Sie bittet sie, ihre Mutter zu suchen, die sie seit ihrer Verhaftung durch Barnaba nicht mehr gesehen hat. Die Sängerin ist hin- und hergerissen zwischen einerseits ihrer Entscheidung, Laura und Enzo wieder zu vereinen und dann Selbstmord zu begehen, und andererseits der Versuchung, zu Enzo zurückzukehren und Laura allein zu lassen. La Giocondas Gedanken werden durch den Schrei eines Gondolier unterbrochen, der behauptet, eine Leiche im Orfano-Kanal gefunden zu haben, und durch die Ankunft von Enzo, den Barnaba freigelassen hatte.
La Gioconda gibt zu, dass sie Laura holen ließ. Enzo wird aggressiv, weil sie ihn glauben ließ, dass Laura tot war. Gerade als er sie töten will, wacht Laura auf und erklärt Enzo, dass es ihre Rivalin war, die sie vor ihrem Mann gerettet hat. La Gioconda hat auch die Flucht des Paares aus ihrem Haus arrangiert: Ein Boot kommt an, um Laura und Enzo abzuholen und sie in Sicherheit zu bringen.
La Gioconda, die auf sich allein gestellt ist, wartet ängstlich darauf, dass Barnaba kommt und seine "Bezahlung" für die Befreiung Enzos entgegennimmt. In Panik versucht sie zu fliehen, wird aber vom Spion erwischt. La Gioconda verspricht, ihm ihren Körper zu geben, wie vereinbart, und sticht sich mit einem Dolch zu Tode. In seiner Wut hat Barnaba sogar noch das letzte Wort: Er ruft den sterbenden Frauen zu, dass er gestern Abend ihre Mutter ertränkt hat.