I. Akt
Die anmutige Jenůfa befürchtet, dass ihr Liebhaber Števa zum Militär eingezogen wird. Sie erwartet ein Kind von ihm, und die Rekrutierung würde die vorzubereitende Hochzeit vereiteln. Auch Števas Halbbruder Laca wirbt um Jenůfa und neckt sie wegen Števa. Der angetrunkene Števa kommt mit seinen Freunden und mit Musikanten in die Mühle – er war doch nicht eingezogen und feiert sein Glück mit Alkohol und Tanzen. Jenůfas strenge Pflegemutter Kostelnička (dt. Küsterin) missbilligt das Verhalten von Števa und seinen Freunden. Vor allen Anwesenden erklärt sie, dass sie die Hochzeit zwischen Jenůfa und Števa erst nach einer einjährigen Prüfung billigen wird, während der sich Števa nicht betrinken darf. Laca versucht Jenůfa zu überzeugen, dass Števa sie nur wegen ihrer Schönheit liebt, und im Streit verletzt er sie mit seinem Messer im Gesicht.
II. Akt
Kostelnička versteckt Jenůfa zu Hause, um der Schande zu entgehen, und behauptet, dass das Mädchen in Wien arbeite. Jenůfa hat mittlerweile einen Sohn zur Welt gebracht. Während Jenůfa schläft, erniedrigt sich Kostelnička vor Števa und bittet ihn, Jenůfa zu heiraten. Für Števa hingegen hat das vernarbte Gesicht von Jenůfa sie hässlich gemacht. Darüberhinaus ist er bereits mit der Tochter des Bürgermeisters verlobt. Dann erscheint Laca und bittet Kostelnička, ihm Jenůfa zur Ehe zu geben. Als ihm aber Kostelnička gesteht, dass Jenůfa Števas Kind geboren hat, ist er bestürzt. In Verzweiflung lügt Kostelnička, dass das Kind unmittelbar nach seiner Geburt gestorben ist. Sobald Laca geht, ertränkt Kostelnička das Kind in einem eisigen Fluss und redet Jenůfa ein, dass sie zwei Tage im Fieber geschlafen habe und der Junge inzwischen gestorben sei. Die gequälte Jenůfa stimmt einer Heirat mit Laco zu.
III. Akt
Während der Vorbereitungen zur Trauung von Jenůfa und Laca kommt die Nachricht, dass ein Kind tot im Fluss gefunden wurde. Jenůfa erkennt die Mütze ihres Söhnchens und wird des Mordes verdächtigt. Kostelnička gesteht vor allen ihre Tat. Ehe sie vom Dorfrichter weggeführt wird, vergibt Jenůfa ihr, weil sie versteht, dass ihre Stiefmutter es nur aus Liebe zu ihr getan hat. Jenůfa glaubt nicht, dass Laca sie noch zur Frau möchte, und schickt ihn weg. Laca verspricht ihr aber, auch in schlechten Zeiten an ihrer Seite zu stehen. Jenůfa begreift, dass sie in ihm ihre wahre Liebe gefunden hat, „mit welcher der Herrgott zufrieden ist“.
