I. Akt
Am Ufer eines Sees inmitten der Wälder necken drei Waldelfen Vodník, den Wassergeist, während sie mit ihm Fangen spielen und ihm immer entwischen. Rusalka, eine Wassernymphe, ist die Tochter von Vodník. Sie ist traurig, da sie sich im Wasser nicht mehr zu Hause fühlt. Sie sehnt sich danach zu fliehen und eine menschliche Gestalt anzunehmen, mit einer menschlichen Seele, damit sie für einen Prinzen, den sie bei der Jagd in der Nähe des Sees gesehen hat, sichtbar wird und so die menschliche Liebe erfahren kann.
Rusalka bittet ihren Vater um eine Lösung. Trotz der ersten Warnungen bringt er sie zur Hexe Ježibaba. Rusalka fleht die Hexe an, sie zu verwandeln. Ježibaba stimmt zu, aber im Gegenzug wird Rusalka ihre Stimme opfern müssen. Außerdem ist die Hilfe von Ježibaba mit einem Fluch verbunden: Wenn Rusalka das Herz des Fürsten nicht gewinnt, wird sie verbannt und dazu verdammt, als Geist für alle Ewigkeit zwischen Leben und Tod zu wandern. Ihr geliebter Prinz wird in Verdammnis leiden. Rusalka erklärt sich mit den Bedingungen einverstanden.
Auf der Jagd, auf den Spuren eines weißen Rehs, begegnen der Prinz und der Jäger Rusalka. Der Prinz ist sofort in ihren Bann gezogen. Er bringt sie auf sein Schloss.
II. Akt
Auf der Burg des Prinzen laufen die Vorbereitungen für einen Ball. Der Küchenjunge erzählt dem Wildhüter, dass der Prinz eine Frau heiraten will, die er in der Woche zuvor aus dem Wald mitgebracht hat. Laut dem Küchenjungen hat der Prinz bereits die Liebe zu Rusalka verloren.
Die Gerüchte, die am Hof kursieren, erweisen sich als wahr: Der Prinz liebt Rusalka nicht mehr. Er ist angewidert von ihrem kalten, feuchten Körper und ihrer unerklärlichen Stille. Eine ausländische Prinzessin bittet den Prinzen, sich besser um seine Gäste zu kümmern. Nachdem der Prinz Rusalka kalt sagt, dass sie sich auf den Ball vorbereiten soll, gehen der Prinz und die Prinzessin gemeinsam zu den anderen Gästen. Rusalka bleibt zurück, allein.
Während die Gäste tanzen und sich auf dem Ball vergnügen, kommt Vodník und beklagt Rusalkas Schicksal. In seiner Gegenwart gewinnt Rusalka ihre Stimme zurück und beklagt sich über ihr Leiden. Die ausländische Prinzessin hat das Herz des Prinzen gewonnen, der Rusalka abgelehnt hat. Vodník droht ihm. Er wird nie in der Lage sein, ihrer Umarmung zu entkommen. Auch die Prinzessin lässt den Prinzen im Stich. Vodník begleitet Rusalka zurück in die Tiefe.
III. Akt
Zurück im Wald, am Ufer des Sees, beklagt Rusalka ihr Schicksal. Ježibaba erscheint vor ihr und bietet ihr einen Ausweg: Wenn Rusalka den Prinzen tötet, kann sie in die Wasserwelt zurückkehren. Rusalka lehnt ihr Angebot ab, da sie sich lieber ihrem Schicksal unterwerfen würde, als den Mann zu töten, den sie liebt. Rusalka wird von den anderen Wassernymphen ausgegrenzt.
Der Wildhüter und der Küchenjunge besuchen Ježibaba, um ihren Rat über den Prinzen einzuholen, der verzweifelt umherirrt. Sie lacht sie aus und sie haben Angst. Als sie Rusalka für den Zustand des Prinzen verantwortlich machen, erscheint der Wassergeist Vodník. Er erinnert sie daran, dass es eigentlich der Prinz war, der Rusalka verlassen hat. Vodník schwört Rache. Die drei Waldelfen beginnen zu singen und zu tanzen. Vodník erzählt ihnen, dass Rusalka zum Leiden verurteilt ist und von ihren Schwestern verbannt wurde.
Der Prinz ist verzweifelt auf der Suche nach seiner verbannten Liebe. Er zeigt Reue und bittet Rusalka um einen Kuss. Sie warnt ihn, dass es fatal enden wird, aber der Prinz besteht darauf. Nach dem Kuss stirbt er in ihren Armen. Rusalka dankt dem Fürsten, dass er sie die menschliche Liebe erleben ließ und übergibt seine Seele Gott. Dann kehrt sie als bludička, ein Irrlicht, an ihren Platz in den Tiefen des Sees zurück, ein Dämon, der dazu verdammt ist, nie zu leben oder zu sterben, der nur entsteht, um die Menschen in ein nasses Grab zu locken.